本文是学习GB-T 34797-2017 核酸引物探针质量技术要求. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了DNA
引物探针的质量评价指标、技术要求、试验方法、包装运输和储存要求。
本标准适用于DNA 引物探针等寡核苷酸产品的质量评价及其检测。
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 191 包装储运图示标志
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义
GB/T 30988 多酚类植物基因组 DNA 提取纯化及测试方法
GB/T 19495.1 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
寡核苷酸 oligonucleotide
二至三十个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。寡核苷酸可由仪器自动合
成，它可作为 DNA 合成的引物、基因探针等。
注：在使用这一术语时，对核苷酸残基的数目并无严格规定，在不少文献中，把含有三十甚至更多个核苷酸残基的
多核苷酸分子也称作寡核苷酸。
3.2
引物 primer
人工合成的两段寡核苷酸序列， 一段与目的基因一端的一条 DNA
模板链互补，另一段与目的基因
另一端的另一条 DNA 模板链互补。
3.3
探针 probe
一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。
3.4
定制序列 custom sequence
客户提供的 DNA 序列及合成要求等信息。
3.5
定制引物 custom primer
客户提供的 DNA 引物序列及合成要求等信息。
GB/T 34797—2017
3.6
定制探针 custom probe
客户提供的 DNA 探针序列、修饰集团及合成要求等信息。
3.7
在 1 mL 体积1 cm 光程标准比色皿中，260 nm 波长下吸光度为1
的寡核苷酸溶液。
3.8
序列比对 alignment
为确定两个或多个序列之间的相似性和同源性，而将它们按照一定的规律排列并分析的过程。
下列缩略语适用于本文件。
DNA: 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
DSL: 脱盐(desalination)
HAP: 新型寡核苷酸纯化(high affinity purification)
HPLC: 高效液相色谱(high performance liquid chromatography)
MS: 质谱(mass spectrometer)
OD: 光密度(optical density)
OPC: 寡核苷酸纯化柱(oligonucleotide purification cartridge)
PAGE: 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis)
DNA 引物探针产品质量控制指标及技术要求应符合表1的规定。
表 1 DNA 引物探针产品质量技术要求
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GB/T 34797—2017
表 1(续)
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产品应为半透明或不透明的片状粉状物质、无异味，易溶于水和TE 缓冲液。
引物探针的总量一般以 OD 来表示，合成产品OD 测量值与定制序列 OD
值作比较，要求总量相对
误差≤10%。
测得的引物探针相对分子质量(MW) 与定制序列 MW
值作比较，要求相对分子质量相对误差
≤0.05%。
5.5 碱基准确性(DNA 序列的一致性)
将合成的引物探针序列与定制序列进行比对，匹配度应达到100%。
合成产品碱基缺失率应符合表1要求。
引物探针纯度主要级别分为"脱盐"级、"过柱"级、PAGE 级、HPLC
级，应满足表1要求。
探针修饰基团定制序列应完全一致。
将合成以后的引物探针进行PCR
扩增以对其试验效果进行评估，包括特异性、效率、产物、引物二
聚体带等。
GB/T 34797—2017
除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，水为GB/T 6682 规定的一级水。
感官判断。
利用紫外分光光度计测定合成DNA 产品的 OD26, 利用吸光度A 等于1 为 1OD
单位来计算合成
DNA 产品的总量。重复测定3次，结果取平均值。
按照GB/T 30988 执行。
相对分子质量可根据引物探针合成单，按照式(1)直接计算。
MW=(A×313.21)+(C×289. 18)+(G×329.21)+(T×304. 19)—61.94
(1)
式中：
MW ——相对分子质量；
A、C、G、T——各碱基对应的碱基数。
注：计算探针相对分子质量时，式(1)应加上相应的修饰基团相对分子质量。常见修饰基团相对分子质量参见表
A. 1。
采用ESI
源电离喷雾技术，负离子模式将样品转化为运动的带电气态离子碎片，按质核比(m/x)
大小分离并记录，通过换算测得相对分子质量。 HPLC 和 MS
的设备及流动相参数参见附录 B。
采用6.3.2方法测得的相对分子质量与6.3.1中计算的相对分子质量相对误差应小于或等于
0.05%。
产品序列和定制引物或定制探针序列的匹配程度，此序列由合成仪后台自动生成并验证。
通过质谱联用仪对合成的寡核苷酸序列进行测定，计算扣除目标峰以外的其他峰高占所有峰高的
比值。
GB/T 34797—2017
采用6.3.2的方法测定，计算目标峰面积占所有峰面积比值得出纯度。
采用高效液相色谱进行纯度测定，具体条件参见附录B,计算峰面积，并与对照进行比较，得出引物
探针纯度。纯度应符合表1的要求。
采用6.3.2的方法测定，通过比较相对分子质量来确定是否含有定制探针的修饰基团。
采用荧光光谱仪，固定激发波长，并以激发波长为起始点对发射波长进行扫描(起始点至900
nm),
验证修饰基团的准确性。对应修饰基团的特征吸收峰参见表C.1。
选择目标产品DNA 作为阳性对照(如水稻、玉米、大豆等),以非目标产品 DNA
作为阴性对照，以 灭菌去离子水为空白对照，进行PCR 扩增(或实时荧光PCR)
试验，根据扩增结果判断试验效果。特异
性验证试验应符合GB/T 19495.1 的要求。
根据扩增图谱查看是否获得特异性条带(或是否有典型扩增曲线)。获得特异性条带(或有典型扩
增曲线),即可判断产品符合要求，引物设计合理。记录格式参见表 D.1。
观察PCR
扩增产物图谱未形成明显的引物二聚体带，空白对照和阴性对照未出现扩增现象，即可
判断产品质量合格，引物设计合理。
贮存于-20℃冰箱，避免反复冻融。未稀释的干粉-20℃保存不宜超过1年；稀释的母液宜小量
分装， -20℃不宜超过半年；稀释的工作液在一20℃不宜超过1个月。
产品应使用1.5 mL、2mL 或 5 mL
的离心管分装，用96孔板固定，或按客户要求进行包装。
干粉成品通过铁路、空运或快递方式常温运输。运输过程中应注意防止重压，避免日晒、雨淋，不
GB/T 34797—2017
得与有毒有害物品同时运输。
产品包装箱外使用标志按照GB/T 191 的规定执行。
引物探针合成后应附合成报告单，或等同的指导性文件。文件内容应至少包括以下部分：
a) 名称；
b) 序列；
c) 长度；
d) 纯化方式；
e) 修饰基团；
f) ODs;
g) μgs;
h) nmoles:
i) %GC;
j) TM;
k) MW;
1) OD per Vial; m)μgs per OD;
n) nmoles per OD;
o) 配制方法及浓度；
p) 保存条件和有效期。
注：相关指标检测分析方法参见附录 E。
试剂盒外包装应标示如下内容：产品名称、生产批号或生产日期、规格和数量、运输和保存温度、有
效期、生产企业名称和地址。
GB/T 34797—2017
(资料性附录)
修饰相对分子质量
表 A.1 常见修饰基团相对分子质量
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| 3'℃6 Spacer |
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| 3'℃3 Spacer |
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5'NH2 C6 |
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| 3'NH2 C6 |
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| 3'SH C6 |
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| 3'SH C3 |
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| 3'NH2 C7 |
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5'SH C6 |
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5'NH2 C12 |
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GB/T 34797—2017
(资料性附录)
HPLC 和 MS 的设备及条件
B.1 DNA 相对分子质量测定
采用 ESI
源电离喷雾技术，负离子模式将样品转化为运动的带电气态离子碎片，按质核比(m/z)
大小分离并记录，通过换算测得相对分子质量。条件如下：
a) 流动相配制参见表 B.1
表 B.1 流动相 A、流动相 B 配制
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10 μmol/L EDTA 10 mL | 990 mL |
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10 μmol/L EDTA 10 mL |
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b) 柱温：40℃;
c) 色谱柱：XBridge Oligonucleotide BEH C,s Column,130A,2.5μm,4.6
mm×50 mm;
d) 流速：0.3 mL/min;
e) 梯度洗脱：流动相B 从5%到30%,15 min;
f) 质谱条件：采用液质联用飞行时间质谱仪(TOF);
g) 毛细管电压：4000 V;
h) 雾化气压力：0.28 MPa;
i) 雾化气温度：350℃;
j) 碎裂电压：150 V;
k) 雾化气：氮气。
B.2 合成 DNA 产品纯度测定
采用高效液相色谱来进行纯度鉴定，条件如下：
a) 色谱柱：XBridge Oligonucleotide BEH Cis Column,130A,2.5 μm,4.6
mm×50 mm;
b) 流动相 A:0.1 mol/L TEAA; 流动相B: 乙腈；
c) 柱温：60℃;
d) 流速：1.0 mL/min;
e) 梯度洗脱：流动相B 从5%到30%,15 min;
f) 检测波长：260 nm。
注：色谱柱可以采用等效的Cis柱。
GB/T 34797—2017
(资料性附录)
修饰基团特征吸收峰
表 C.1 修饰基团特征吸收峰一览表
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| 3'NH2 C7 |
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GB/T 34797—2017
(资料性附录)
引物探针验证记录格式
表 D.1 引物探针验证记录格式
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GB/T 34797—2017
(资料性附录)
引物探针相关指标检测分析方法
E.1 Oligo DNA 质量数的计算
按照每个OD 约等于33μg 来计算质量数(见示例1)。
示例1:
1 管5 OD₂ 的20 mer Oligo DNA
质量数=5×33=165 μg;
摩尔数=165÷5652.75=0.029 μmoL=29 nmoL;
若加双蒸无菌水400 μL 溶解，则浓度为：29 nmoL÷400pL=72.5 μmol/L。
E.2 Oligo DNA 电泳分析
采用7 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺电泳和1倍 TBE
Buffer进行电泳。为防止加样时的扩散和二级
结构的影响，样品上样前应加饱和尿素处理。
E.3 Tm 值的计算
Tm 值计算方法有以下几种：
a) 软件得出
Tm 值可以从引物评价分析软件中直接得出，如 Oligo 6 等。
b) 4(G+C)+ 2(A+T)法
长度在25 mer 以下的引物，Tm 值可以按照式(E.1)计算得出：
Tm=4(G+C)+2(A+T) … … … … … … … …(E. 1)
c) GC 含量法
对于较长的寡聚核苷酸引物，Tm 值可以按照式(E.2) 计算得出：
Tm=81.5+16.6×Logu[Na+]+0.41×(%GC)-600/size
式中：
size———引物长度。
更多内容 可以 GB-T 34797-2017 核酸引物探针质量技术要求. 进一步学习